腺病毒載體構(gòu)建與包裝

1. 基因調(diào)取與腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 針對(duì)客戶感興趣的基因，從NCBI網(wǎng)站上得到目的基因CDS區(qū)信息并設(shè)計(jì)引物，從文庫(kù)中調(diào)出基因，克隆至腺病毒系統(tǒng)穿梭載體（Pshuttle-CMV）。如需克隆的為基因突變體，則將基因克隆至穿梭載體后，行若干次點(diǎn)突變，至得到需要的突變體為止。 2. 腺病毒骨架質(zhì)粒的同源重組 將攜帶目的基因片段的穿梭質(zhì)粒線性化后與腺病毒大骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入在特定的大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，由于腺病毒骨架質(zhì)粒是氨芐抗性，而與穿梭質(zhì)粒同源重組后，氨芐抗性丟失，同時(shí)表達(dá)卡那霉素抗性，因此，通過(guò)抗性的變化可篩選出腺病毒載體骨架重組子，挑取重組子進(jìn)行酶切鑒定，挑選酶切鑒定正確的克隆，進(jìn)行下一步腺病毒載體的包裝。 3. 腺病毒載體的包裝與擴(kuò)增 將篩選到的重組腺病毒運(yùn)用脂質(zhì)體法（LipoFiter，Hanbio公司）轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，由于腺病毒載體基因組中的早期基因E1缺失，利用帶有E1 基因的293 細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，一至兩周即可包裝出E1缺失的腺病毒載體，通過(guò)倍比擴(kuò)增，富集病毒顆粒。對(duì)絕大多數(shù)的細(xì)胞株可以達(dá)到近乎100%的感染效率。
2.構(gòu)建流程圖