siRNA/shRNA載體構(gòu)建

實驗方法原理；多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆 到相應(yīng)載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆 ，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆 的序列是正確的。

 設(shè)計siRNA靶序列；在制備siRNA 前都需要單獨設(shè)計siRNA序列.研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞,較有效的siRNAs是21-23個堿基大小、3'端有兩個突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物，比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)謹(jǐn)，與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。