抗CD44納米抗體制備與鑒定

　　急性髓系白血病（AML）是一種異質(zhì)性血液癌癥，目前主要的治療方法是化療和骨髓干細(xì)胞移植，但化療的特異性和配型的成功率均較低，因而患者的治愈者并不高。基于此，已有對(duì)于AML治療的新型小分子靶向藥物和免疫靶向藥物的研究，可通過(guò)靶向AML細(xì)胞提高患者的治愈者和整體生存率。研究表明，CD44在AML細(xì)胞表面高表達(dá)，且參與AML干細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展，并已有靶向AML細(xì)胞表面分子CD44的治療性抗體的研究。但是，傳統(tǒng)單克隆抗體制備過(guò)程繁瑣，且人源化過(guò)程復(fù)雜，故難以將理論研究轉(zhuǎn)化到實(shí)際應(yīng)用。因此，本課題選擇CD44作為靶標(biāo)，并篩選易人源化的納米抗體，為進(jìn)一步研制新一代治療AML的靶向性藥物奠定基礎(chǔ)。

　　抗CD44納米抗體制備研究方法：

　　1.CD44胞外結(jié)構(gòu)域抗原的制備：構(gòu)建CD44原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，通過(guò)包涵體復(fù)性的方式制備抗原，并進(jìn)行SDS-PAGE和ELISA分析。

　　2.抗CD44納米抗體的噬菌體文庫(kù)構(gòu)建：將表達(dá)的CD44抗原對(duì)健康雙峰駝進(jìn)行免疫，通過(guò)細(xì)胞分離，總RNA提取以及PCR等方法將編碼納米抗體的核酸序列連接到噬菌體載體上，構(gòu)建抗CD44納米抗體的噬菌體文庫(kù)。

　　3.抗CD44納米抗體的篩選：利用噬菌體展示納米抗體和固相抗原的結(jié)合，通過(guò)數(shù)輪的“結(jié)合-洗脫-結(jié)合”后富集特異性結(jié)合的噬菌體，之后進(jìn)行菌液ELISA和序列分析，從而獲得抗CD44的納米抗體。

　　4.抗CD44納米抗體的表達(dá)純化以及特異性和活性的初步研究：構(gòu)建抗CD44納米抗體的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌WK6菌株中，經(jīng)過(guò)鎳親和層析和分子篩進(jìn)行純化；通過(guò)ELISA方法對(duì)抗CD44納米抗體的特異性和活性進(jìn)行初步鑒定。