蛋白表達是什么？

　　大腸桿菌是目前應(yīng)用廣泛的蛋白表達系統(tǒng)，其表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其它基因表達系統(tǒng)，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的80%。本實驗中，攜帶有目標蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中，在37℃，IPTG誘導下，超量表達攜帶有6個連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質(zhì)加以提純，實為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質(zhì)的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電冰進行分析。

　　蛋白表達操作步驟：

　　一、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導

　　1.接種含有重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌BL.21菌株于5mL.LB液體培養(yǎng)基中（含100ug/ml氨芐青霉素），37C震蕩培養(yǎng)過夜。

　　2.轉(zhuǎn)接lml過夜培養(yǎng)物于100mL（含100ug/l.氨芐青霉素）LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至0D600=0.6-0.8。取10u1樣品用于SDS-PAGE分析。

　　3.加入IPTG至終濃度0.5mmol/1，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1-3h.

　　4.12，000rpm離心10min，棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。

　　二、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離，純化

　　1.NTA層析柱的準備：在層析柱中加入1ml.NTA介質(zhì)，并分別用8l去離子水，8mL.上樣緩沖液洗滌。

　　2.重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入5ml.上樣緩沖液，用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60min，4℃12000rpm離心30min，將上清吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。取10u1上清樣品用于SDS-PAGE分析。

　　3.上清樣品以10-15ml./h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10u1樣品用于SDS-PAGE分析。

　　4.洗脫雜蛋白：用Washing Buffer以10-15ml./h流速洗柱，直至0D280=0.01.分步收集洗脫液，約3-4h，取10ul洗脫開始時的樣品用于SDS-PAGE分析。

　　5.洗脫目標蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1l.級分，分別取10u1樣品用于SDS-PAGE分析。