技術(shù)服務(wù) 哺乳動物細(xì)胞雙雜交服務(wù)

艾柏森（北京）生物科技有限公司

酵母雙雜交檢測實驗技術(shù)服務(wù)

　　隨著分子生物學(xué)研究尤其是人類基因組計劃的迅速發(fā)展，為適應(yīng)對眾多基因或蛋白進行功能研究的發(fā)展趨勢，已出現(xiàn)了很多新技術(shù)。其中酵母雙雜交技術(shù)以其簡便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用等特點在基因功能的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。

　　蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎(chǔ)，研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響的實驗，同以往研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用的實驗手段相比，酵母雙雜交系統(tǒng)具有其*優(yōu)勢。

1、融合體蛋白之間的相互作用是在真核酵母細(xì)胞內(nèi)進行，蛋白質(zhì)保持天然的折疊狀態(tài)，這是其他離體生化檢驗方法所缺乏的，它所證實的蛋白質(zhì)間相互作用將更接近于體內(nèi)的真實水平。
2、雙雜交系統(tǒng)的敏感度非常高，蛋白質(zhì)之間結(jié)合常數(shù)低至1mmol/L時都可以被偵測。
3、在篩選cDNA 文庫時，雙雜交系統(tǒng)能夠簡捷地得到編碼相互作用蛋白的基因序列，它只需構(gòu)建質(zhì)粒而不必準(zhǔn)備抗體或純化蛋白，省略了其它體外檢測蛋白之間相互作用方法所必須的蛋白抽提、純化等繁瑣步驟。

酵母雙雜交實驗原理：

　　以Gal4系統(tǒng)為例，BD和AD分別由Gal4蛋白上不同的兩個結(jié)構(gòu)域(1-147aa與768-881aa)構(gòu)成。在利用GAL4系統(tǒng)篩選cDNA文庫或研究蛋白間的相互作用時，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即"誘餌"相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結(jié)合。一般情況下，單獨的BD可以與GAL4上游活化序列（GAL UAS）結(jié)合但不能引起轉(zhuǎn)錄，單獨的AD則不能與GAL UAS結(jié)合；只有當(dāng)BD與AD分別表達的融合蛋白由于相互作用而導(dǎo)致兩者在空間上相互靠近時，BD與AD才能與GAL UAS結(jié)合并且引起報道基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活下游報告基因，通過這一系列實驗來驗證兩個蛋白之間的相互作用。

★ 酵母單/雙雜交檢測服務(wù)項目列表

服務(wù)一、酵母單雜交文庫構(gòu)建服務(wù)

　　酵母單雜交體系能在一個簡單實驗過程中，識別與DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，同時可直接從基因文庫中找到編碼蛋白的DNA序列，而無需分離純化蛋白，實驗簡單易行。為了獲得良好的酵母單雜交篩選實驗結(jié)果，構(gòu)建酵母單雜的文庫至關(guān)重要，我們可以依據(jù)不同的實驗需要及物種特性，選擇不同的體系建庫方法，我們的技術(shù)專家可以熟練的應(yīng)用Clonetech的SAMRT方法和life的gateway方法建立，同時，我們的技術(shù)專家也開發(fā)出了基于同源重組原理的建庫方法。

★ 酵母單雜交文庫構(gòu)建實驗流程： 
 1. RNA提取 
 2. mRNA提取 
 3. cDNA的酶促法合成
 4. cDNA連接接頭 
 5. cDNA按長度分離 
 6. cDNA與酵母單雜交文庫載體pGADT7進行all-direct重組 
 7. 重組產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化 
 8. 文庫檢測以及質(zhì)粒提取

★ 酵母單雜交文庫構(gòu)建實驗材料要求： 

客戶構(gòu)建的酵母單雜交cDNA文庫，由客戶提供組織、細(xì)胞或總RNA給我們即可：

細(xì)胞樣本：細(xì)胞數(shù)量大于1*10^7；

動物樣本：大于1g；

植物樣本：大于2g；

總RNA：大于200ug。